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外泌体分离方法哪种好?

外泌体(exosomes)是细胞分泌的纳米级小泡,这些微囊泡的直径通常约30-150纳米,内部包含注册送28元现金筹码质、RNA等重要细胞分子。之前的研究表明,外泌体可作为癌症、神经退行性疾病、肾脏疾病的诊断标志。近几年外泌体的分离技术得到了明显的进步和发展,外泌体分离方法哪种好呢?下面各大方法详细介绍:

 

1、超速离心法

外泌体分离-超速离心法

超速离心法是最常用的外泌体纯化手段,在以低速离心除去掉死亡细胞和细胞碎片后,就通过高速离心将大小相同的囊泡颗粒从可溶性分子如游离注册送28元现金筹码质和注册送28元现金筹码质复合物中沉淀并纯化出来。重要的是,随后要用PBS或新鲜生长培养基至少一次的清洗外泌体,从而来减少其中游离的残存注册送28元现金筹码。此外,所有离心步骤必须在4°C下进行,借此来保持注册送28元现金筹码酶、DNase和RNases处于非活性状态。

通常超速离心也会与蔗糖密度梯度(其密度从低到高的连续分布)或蔗糖垫(30% sucrose cushion)组合使用,即在离心机中以100,000-200,000 x g离心沉淀(含有外泌体)120分钟,可使样品中的外泌体应将以1.13-1.19g/mL的蔗糖密度范围内进行富集。

尽管这种强强联手的方法可以获得高度纯化的外泌体,但也存在一些缺点。确实,超速离心的过程耗时耗力,且需要耗费大量的原料。而最大的缺陷在于重复离心操作很有可能对外泌体的囊泡造成损害从而降低其质量,又或者样品中的可溶性注册送28元现金筹码可能与外泌体一起形成聚集体和团块进而产生污染。

 

2、超滤离心法

外泌体分离-超滤离心法

考虑到外泌体是一个大小约几十纳米的囊状小体,大于一般注册送28元现金筹码质,也可依据其大小来分离外泌体,如超滤和尺寸排阻色谱(SEC)。


超滤是利用不同截留相对分子质量(MWCO)的超滤膜对样品进行选择性分离,即将溶剂即部分小分子物质过滤到膜的另一侧,而将大于膜孔径的高相对分子质量物质截留在超滤膜上,以此达到分离外泌体的目的。


该方法简单高效,且不影响外泌体的生物活性,是研究外泌体RNA的最佳方法,因为它比超滤和沉淀法产生更大的RNA产量。同样可以通过纳米过滤浓缩器。但超滤的主要缺点就是外泌体可能会阻塞过滤孔,导致膜的寿命减短,分离效率较低。


外泌体膜之间也会发生互相黏附,致使低分离产量,甚至会出现错误的检测结果。此外,基于体积大小分离外泌体的方法还有一个需要解决的干扰,那就是与外泌体大小相似的大量非外泌体的纳米囊泡的存在。


在SEC中,柱内固定的多孔相也可利用重力流原理,依据分子大小来进行选择性分离。小分子能够穿过孔隙导致后期洗脱,而较大的组分(包括外泌体)则可绕过孔隙提前被洗脱。此方法可使外泌体完整性和生物活性得到极大保留,且与差速离心结合获得高度纯化的外泌体。

 

3、PEG-base沉淀法

聚乙二醇( PEG,8000 kDa)可竞争性结合游离水分子,从而使溶解度较小的分子或外泌体从溶液中析出。早期该方法被应用于从血清等样本中收集病毒,现也被用来沉淀外泌体。通常是4℃用PEG孵育样品过夜,随后通过低速离心或过滤即可沉淀回收外泌体。


但该方法也存在一些问题:比如外泌体的纯度和回收率低,存在假阳性(杂注册送28元现金筹码较多或一些难以去除的聚合物),机械力或化学添加物对外泌体产生破坏等。


而另一种方法是,如果你已知外泌体的糖链组成,可用凝集素来富集外泌体。凝集素是一种可与碳水化合物结合的注册送28元现金筹码质,在凝集外泌体后低速离心即可。而近年来,基于沉淀的原理来分离外泌体,市场上也研发各种商业化的外泌体提取试剂盒,操作简单,无需超速离心,就可获得高纯度和高回收率的外泌体。

 

4、磁珠免疫法

外泌体分离-磁珠免疫法

由于外泌体中富含注册送28元现金筹码质,且其表面具有很多特异性标志性受体,如CD9,CD81,CD63,CD82,Hsp70,Ras相关注册送28元现金筹码Rab-5b,细胞骨架注册送28元现金筹码肌动注册送28元现金筹码和TSG101,因而可用包被抗标记物抗体的磁珠与外泌体共同孵育后,即可捕获它们
 

又因为外泌体的异质性与它们的起源相一致,所以在不同的外泌体上的这些标记物的丰度也是不同的。因此,你可以通过特定的抗体组合从样本中捕获不同类型的外泌体,在将这些抗体固定在ELISA平板、磁性或层析珠上、又或者微流体装置上,来对外泌体进行选择性分离。
 

虽然免疫亲和技术具有高特异性、可获得高纯度的外泌体、且不影响外泌体形态完整等优点,是富集表征独特的外泌体的优选方法。但是此方法效率低,外泌体内含物的生物活性易受PH和盐浓度影响,不利于下游实验的进行。

 

5、PS亲和法

该方法将PS(磷脂酰丝氨酸)与磁珠结合,利用亲和原理捕获外泌体囊泡外的PS。该方法与免疫磁珠法相似,获得的外泌体形态完整,纯度最高。由于不使用变性剂,不影响外泌体的生物活性,外泌体可用于细胞共培养和体内注射。2016.9 《Scientific Reports》 杂志发表了该方法最新数据,表明PS法可提取相当高纯度的外泌体.


6、色谱法

这种方法分离到的外泌体在 电镜下大小均 一, 但是需要特殊的设备 , 应用不广泛 。


了解了六种分离外泌体的方法优缺点, 而近几年各大CNS级别的文章大多数使用的方法-超速离心,如果是想找个稳妥的方法可选择超速离心,当然都有利弊, 也可根据个人偏好选择。

 

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