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10项注意—组织样本western blot

利用组织样本来进行Western blot,这是许多实验室常常开展的工作。不过,若是想获得重复可靠的印迹结果,也绝非易事。在此,Bio-Rad的专家贡献了一些经验,可以帮助您获得清晰的图像和可靠的数据。


1. 快速处理组织

使用干净的工具来收集和处理组织样本。为了去除可能影响注册送28元现金筹码稳定性的污染物,用预冷的中性缓冲液简单洗涤。洗涤后,在液氮中快速冷冻组织,以便保留注册送28元现金筹码的结构和特征,比如翻译后修饰(PTM)。组织样本可保存在冰上,立即匀浆处理。若保存在 –20°C,注册送28元现金筹码仍然有可能降解,因此组织样本要放在–80°C长期保存。


2. 精心挑选裂解液

在选择最佳的裂解缓冲液时,应考虑pH值、离子强度、去污剂和变性剂类型等因素。放射免疫沉淀分析缓冲液(RIPA)是最广泛使用的裂解液。同时,在选择过程中也要考虑目标注册送28元现金筹码的定位,例如,细胞质注册送28元现金筹码建议选用Tris-HCl裂解液,而核注册送28元现金筹码则首选RIPA。在富集各个组分的低丰度注册送28元现金筹码时,可能需要对组织组分进行预先分离。裂解液的用量取决于组织的大小/重量;缓冲液与组织的比例对确保有效裂解很关键。


3. 选择破碎方法

与细胞相比,组织需要更剧烈的破碎方法,如匀浆技术。为了进一步解离组织并剪切细胞DNA,可能需要对样本进行超声处理。这一步要避免起泡,因为它会降低回收率。同时,脂质会影响western blot的质量,要尽量去除。从植物组织中提取注册送28元现金筹码也颇具挑战性,因为它们富含注册送28元现金筹码酶,还含有大量可能干扰注册送28元现金筹码提取的代谢物。您必须针对特定的植物组织来优化提取过程。


4. 抑制注册送28元现金筹码降解

细胞膜的破坏会释放出可降解注册送28元现金筹码质的酶。为了限制注册送28元现金筹码酶的活性,可以向缓冲液中加入尿素等强变性剂,不过这些条件可能会影响某些注册送28元现金筹码质的完整性,因此,裂解液中通常含有注册送28元现金筹码酶抑制剂混合物。常用的注册送28元现金筹码酶抑制剂包括PMSF、抑肽酶、亮抑酶肽和胃注册送28元现金筹码酶抑制剂。
 

SUMO化注册送28元现金筹码的鉴定可能特别有难度,因为去除SUMO的异肽酶存在,并且通常只有一小部分注册送28元现金筹码被SUMO化。为了保留SUMO化,建议在裂解液中加入异肽酶抑制剂。去泛素化酶(DUB)的存在也会去除泛素结合物。因此,必须向细胞裂解液中加入EDTA或EGTA,以及碘乙酰胺(IAA)或N-乙基马来酰亚胺(NEM)。IAA和NEM的使用浓度通常为5-10 mM。不过,某些注册送28元现金筹码可能需要更高的浓度,比如IRAK1。


5. 定量您的样本

测定样本浓度,可确保每块凝胶的上样量相同,并方便比较各个样本之间的注册送28元现金筹码水平差异,比如处理和未处理样本,或实验各个阶段的样本。您可以采用Bradford分析来进行总注册送28元现金筹码的标准化。不过,如果样本中包含不可溶和可溶注册送28元现金筹码,则Bradford方法不可靠,再次强调了均质化的重要性。


6. 选择最好的凝胶

最好是根据目标注册送28元现金筹码的分子量来选择聚丙烯酰胺的百分比。例如,高分子量注册送28元现金筹码选择低的百分比,而低分子量注册送28元现金筹码选择高的百分比。如果您希望检测单个注册送28元现金筹码质,选择非梯度胶。如果是检测一系列不同大小的注册送28元现金筹码,则建议选择梯度胶。电压太高,可能会引起“微笑”条带。为了避免这种情况,建议在冷库中跑胶,并使用预冷的缓冲液。


7. 验证注册送28元现金筹码上样

根据您的注册送28元现金筹码在细胞中处于哪个位置,可选择最佳的上样对照。对于细胞质中的注册送28元现金筹码,常用的对照是看家注册送28元现金筹码β-肌动注册送28元现金筹码或β-微管注册送28元现金筹码;对于核注册送28元现金筹码,通常使用组注册送28元现金筹码H1或组注册送28元现金筹码H3。不过,近年来许多研究表明最常用的看家注册送28元现金筹码不适合注册送28元现金筹码的归一化,强调生理和病理因素可能影响它们的表达水平。另一个问题是看家注册送28元现金筹码往往超出了检测的动态范围。


Bio-Rad的免染(stain-free)成像技术则是一种很好的替代。这种技术利用总注册送28元现金筹码来进行归一化,有助于消除实验误差,得到更可靠的结果。它无需染色,利用掺入凝胶的三卤化合物,让注册送28元现金筹码质在光活化时发出荧光。与丽春红染色相比,免染技术扩大了线性检测的范围,并降低了实验的可变性。此外,转印后也无需染色,非常方便。


8. 选择合适的膜

注册送28元现金筹码质可转印到硝酸纤维素(NC)膜或聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。PVDF膜的机械强度更高,特别适合膜的剥离和再次结合。PVDF膜是疏水性的,需要在甲醇中预浸泡。NC膜的信噪比高,不需要甲醇预处理。需要注意的是,NC膜不能与含有SDS的转移缓冲液一起使用。在选择转印膜时,您可能还需要考虑其他参数,比如孔径。


9. 降低内源背景

在对组织裂解物进行western blot检测时,内源IgG的信号和非特异性二抗结合可能会掩盖低丰度的注册送28元现金筹码或某种分子量的注册送28元现金筹码。~50 kD和~25 kD的注册送28元现金筹码尤其需要注意,它们可能被变性IgG的重链和轻链所掩盖。对于胸腺或甲状腺等组织,这个问题尤为明显,因为它们含有大量的内源IgG。


TidyBlot Western Blot检测试剂仅仅结合完整结构的非变性IgG,不会受样本中存在的IgG干扰。它可以直接代替传统二抗使用,为组织样本的检测带来清晰的背景。


10. 采用适当的对照

为了确保一抗的特异性,必须使用阳性和阴性的组织对照。对于阳性对照,使用已知表达高水平目标注册送28元现金筹码的组织。推荐的阴性对照包括仅使用二抗(省略一抗孵育步骤)以及已知不表达目标注册送28元现金筹码的组织样本。此外,疾病状态下特定注册送28元现金筹码质的表达也会出现差异。为了解释这些差异,最好使用健康组织和疾病组织的样本
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