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常见流式细胞术问题解答

1、用于做Western 或ELISA的一抗可否用于流式细胞术?

看你说明书上是怎么说的了,如果没有说就不可以做流式,需要另外买了。

辉骏生物流式细胞术

2、请问流式细胞术单抗直接荧光需要几种对照?

首先确认你用的直标抗体的荧光染料是什么,再确定该抗体的来源种属,选择相应的同型对照。如:你现在想检测小鼠淋巴细胞表面的CD4抗原, 荧光染料为FITC, 抗体来源为大鼠的IgG1亚型, 即Rat anti Mouse CD4-FITC (IgG1), 你所需要的同型对照就应该是Rat IgG1-FITC, 一般的抗体说明上都会写清。
 

3、6孔板的细胞量能否做流式呀?

对于6孔板而言,每孔的表面积为10 cm2,依细胞种类不同在长满时达到的数量从5*10的5次方到5*10的6次方不等。6孔板绝对没问题的!甚至24孔板也可以正常做。不过用于调试仪器参数的正常细胞要多准备一些。


4、流式中检测细胞表面和细胞内注册送28元现金筹码表达水平的抗体有何区别?

抗体只是针对相应抗原的,至于是针对胞内还是胞膜对你检测来说并无明显影响,你只需要查清楚到底是针对哪一个部位的抗原的,应该是可以用同一种抗体进行检测的,在流式操作时只需注意:如果是针对胞内,则需要加破膜剂,让抗体能和相应抗原接触,否则就不需要了。


5、只要是荧光抗体就可以用于共聚焦显微镜吗?

一般情况下都是可以的。但有时候强度不够,需要选择荧光强度大的染料。


6、流式细胞仪检测细胞周期是否需要鸡红细胞作参照?

不用,标准微球做完laser alignment(光路校正)就可以了。尽量把微球的各色CV值控制在1.5以内。

 

7、流式细胞仪上的FL2-W FL2-A FL2-H 分别是做什么的?

FL2-W是只检测荧光的脉冲宽度, FL2-H是指脉冲高度。通常在做细胞周期分析时应用,用于去除粘连细胞。

 

8、细胞膜注册送28元现金筹码变化是用流氏检测好,还是要做western?

膜注册送28元现金筹码的提取,好像很费功夫,提取的不好,western结果也就不可信。流式需要的抗体很少,流式能够检测阳性表达细胞的比例,western能对总的表达定量,各有有缺点。

 

9、培养细胞的bcl-2及Bax注册送28元现金筹码的检测?

首先制成单细胞悬液,PBS洗涤后用胞内染色试剂盒(很多公司都有,其实就是固定剂加增透/打孔剂)进行处理,再进行抗体孵育标记染色,洗涤后上样。

 

10、如何分选原始红细胞?

CD71(转铁注册送28元现金筹码受体)--幼稚细胞的标记、CD235(GPA)--红细胞的标记(小鼠有Ter119)、双阳性细胞即为幼稚红细胞,但无法区分原始及中晚幼红.

 

11、怎样选择流式同型对照?

同型对照(Isotype Control):使用与一抗相同种属来源、相同亚型、相同剂量和相同的免疫球注册送28元现金筹码及亚型的免疫球注册送28元现金筹码,用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色。如果一抗是多抗,可以用an normal serum(与一抗相同的正常血清) (must be the same species as primary antibody)。This control is easy to achieve and can be used routinely in immunohistochemical staining.这个可以咨询试剂商。同型对照为免疫荧光标记中的阴性对照。由于荧光标记单抗的组来源不同,应选用相同来源的未标记单抗作为同型对照来调整背景染色。举个例子:比如检测一抗为单抗的mouse anti rat CD11b,clone OX-42 purified IgG,那么它的isotype 是mouse IgG2a, 所以可以用purified(纯化的) mouse IgG2a来做OX-42的同型对照(Isotype Control)。一般的的生物技术公司和国内的代理都有出售。

同型对照:是指与MoAb相同的、未免疫小鼠的免疫球注册送28元现金筹码亚类,若使用直接免疫荧光染色法,同型对照也应标记荧光色素,如IgG1 FITC、IgG2a、PE等。主要考虑了细胞的自发荧光、FC受体介导的抗体结合和非特异性抗体结合等影响因素。此外,同型对照与MoAb所标记的荧光色素、浓度、F:P比值(标记的荧光色素与免疫球注册送28元现金筹码分子的比值)应该相同为最佳,这对准确设定阴性与阳性细胞的界标有重要意义,切忌使用与MoAb不相匹配的同型对照,最好为同一实验室、采用相同工艺或方法制备(如同一品牌)的产品。


12、流式细胞技术测定细胞内游离钙浓度为何要使用氯化钙。

在文献及其他专业网站中都有测定游离钙的方法,具体如下:

(1) 钙荧光探针负载;

(2)随机测定每管细胞悬液样品(以下简称样品)的单个细胞的荧光强度,记为F值。

(3)加入10%Triton X 100,(破膜用);加入1 mmol/L氯化钙,(问题所在),吹打均匀,孵育1~10min,测定荧光即Fmax值。

(4)加入EGTA,20%26mu;l(钙螯合剂),孵育1~10min,激发波长488nm测定荧光,即Fmin值。这个过程中的氯化钙的作用如何, 请高人指点, 谢谢。

因为正常血浆中Ca2+浓度是1mM,细胞外液的Ca2+对细胞内Ca2+有影响。加0.1%triton是增加膜通透性,使细胞外Ca2+进入细胞内,作为最大值。加EGTA是为了螯合Ca2+,作为最小值.生理环境中细胞内钙离子浓度远低于细胞外液(大约1:10000),细胞膜对钙的通透性变化对细胞内钙影响很大。


13、流式与werstern的区别有哪些?

(1)Western 是检测注册送28元现金筹码表达的金标准,可用于检测细胞多种类型的注册送28元现金筹码;流式细胞术的方法多用于检测细胞膜注册送28元现金筹码,虽然也可通过Triton-X100给细胞打孔的方法来检测胞内注册送28元现金筹码,但对于分泌注册送28元现金筹码却是无能为力的;

(2)Western测注册送28元现金筹码含量对抗体的量需要很少,一般1:1000左右,而流式对抗体的需要量很大,一般1:50(很浪费抗体);

(3)采用Western方法检测细胞注册送28元现金筹码含量的变化一般要有内参,而流式一般要把每个样品分为两份,同时都做只加二抗(FITC标记的)的对照,这样平均到每个细胞的发光就不用内参了;

(4)流式用多抗不好,单抗标出来不错。不过流式的应用原理主要还是抗原和抗体反应和western、免疫组化没有本质差别,但是由于免疫组化和western都有酶催化底物的放大体系,因此,流式不适合检测低表达的注册送28元现金筹码,低表达的还是采用western(尤其是化学发光底物更佳)和免疫组化更好。当然,流式最大的一个特点就是,可以定量(百分比),如果是高表达的用流式细胞仪非常有优势。

 

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