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腺病毒感染目的细胞预实验

腺病毒感染目的细胞预实验目的:
确定腺病毒感染目的细胞的最低病毒量,各个细胞株的腺病毒转导效率都不太一样, 其中尤以淋巴细胞株最难转导。


具体实验步骤:

1.    实验前一天收集处于对数生长期,生长状态良好的目的细胞,用完全培养基稀释至1×105cells/mL,接种于96孔板(至少接种15个孔的量),每孔接种100  μL上述细胞悬 液(即1×104 cells/well)。5% CO2、37 ℃ 二氧化碳培养箱内培养过夜。
 

2.    准备12个无菌的1.5 mL EP管,分别加入180 μL的完全培养基。
 

3. 有限稀释法稀释病毒,从10-1~10-12:取20 μL腺病毒原液加入到第一个管的180 μL完全 培 养基中做1:10稀释(10-1);然后以此为起点,从第一个管取20 μL稀释液到第二管 再做1:10稀释(10-2),直至稀释到10-12。
 

4.    从孵箱取出96孔板,显微镜下观察确定细胞生长状态均良好。吸掉孔内旧的培养基, 按10-1~10-12的浓度梯度,依次加入100 μL的病毒稀释液到接种有目的细胞的96孔板中, 每种浓度接种一孔,没有加入病毒液的细胞孔中加入同样体积的完全培养基作为对照 组。37  ℃,5%CO2二氧化碳培养箱内培养。
 

5.    6-12 h以后观察细胞状态。如果细胞实验组与空白组无明显差异,表明病毒对细胞无明 显毒性反应,不要换液,继续培养。
 

6.    由于腺病毒感染能力强,请分别在感染后的12、24、48 h观察细胞中的荧光表达情况。 综合细胞生长状态以及荧光表达量来判断具有最佳作用效果的病毒稀释度,并以此稀 释度作为后续试验的依据。
 

注意: 在进行细胞转导时,请选择生长状态良好的细胞进行感染,并根据适当的 MOI 值以确定好适宜的感染剂量,过高滴度的感染剂量会对细胞产生毒性甚至死亡。若是 用于免疫实验,请根据不同的动物和不同的免疫途径确定合适的免疫剂量。

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