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腺病毒滴度检测方法(TCID50法)

【辉骏生物】腺病毒滴度测定采用 TCID50 方法,具体方法和步骤如下:

1.    实验前一天收集处于对数生长期,生长状态良好的 293A 细胞,用完全培养基稀释至
105 cells/mL,96 孔板每孔接种 100 μL 上述细胞悬液(104 cells/well)。5% CO2, 37 ℃ 二氧化碳培养箱内培养过夜。

 
2.    准备 12 个无菌的 2 mL EP 管,在第一个 EP 管加入 180 μL 的完全培养基,其余的 11
管分别加入 1170 μL 的完全培养基。
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3.    有限稀释法稀释病毒,从 10-1~10-10:取 20 μL 腺病毒原液加入到第一个管的 180 μL 完
全培养基中做 1:10 稀释(10-1),然后从第一个管取 130 μL 稀释液到第二管做 1:10 稀 释(10-2);以此为起点,再从第二管中取 130 μL 稀释液到第三个管做 1:10 稀释(10-3), 直至稀释到 10-10。

4.    从孵箱取出 96 孔板,显微镜观察确定细胞生长状态均良好。吸掉孔内旧的培养基,只
接种稀释度 10-5~10-12,每种浓度接种 10 孔(一横排的 1 到 10 号孔),每孔加入 100 μL
的病毒稀释液到接种有目的细胞的 96 孔板中,没有加入病毒液的细胞孔中加入同样体 积的完全培养基作为对照组。37 ℃,5% CO2 二氧化碳培养箱内培养。

5.    逐日观察并记录结果,无需换液,一般需要观察 8~10 d。

6. 10 d 左右倒置显微镜下观察各孔 CPE 现象,计算每一排中出现 CPE 的孔数。只要有 一小点或是一些细胞出现 CPE 即为阳性,如果无法确定,可与阴性对照比。应同时满 足以下条件方有效:
1) 至少有一个样品的稀释度的10个孔中的每个孔都出现明显的CPE现象。
2) 至少有一个样品稀释度的10个孔中最少有5个但不多于9个孔出现明显CPE现象。
3) 至少有一个样品稀释度的10个孔中最少有1个但不多于5个孔出现明显CPE现象。
4) 至少有一个样品稀释度的10个孔中无任何明显的CPE现象。 结果按 Reed-Muench 两氏法计算(见表 1)。

例:              表 1 Reed-Muench 两氏计算方法
辉骏生物——腺病毒滴度检测方法:两氏计算方法
 
 
含义:将该病毒稀释接种 100 μL 可使 50%的细胞发生病变。即为 1010.42/mL。 将 TCID50/mL 转换为 PFU/mL:


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